常見的轉染方法有哪些種？ 什么是細胞轉染？

說到轉染法，小伙伴們應該比較熟悉脂質體轉染，那么細胞轉染你了解多少呢？本期AVT小編給大家分享一下這個方面的一些知識，感興趣的來看一下吧！

細胞轉染對初接觸細胞實驗的科研人員而言，是一道難過的坎兒，細胞轉染率低的話，你珍貴的細胞可能就只能扔掉了。

大家都知道，細胞是由帶負電荷的磷脂雙分子層構成，這對大分子物質來說是個不可透過的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，為了使核酸穿過細胞膜，開發(fā)了多種技術，大致可分為物理介導、化學介導和生物介導。

幾種常見的轉染方法：

1、脂質體轉染法

陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成DNA脂復合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞進入細胞。脂質體轉染適用于把DNA轉染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細胞中，是目前實驗室***的轉染方法之一，其轉染率較高，優(yōu)于磷酸鈣法。

2、磷酸鈣共沉淀法

該方法可重復性差，而且磷酸鈣溶液對溫度、pH和緩沖鹽濃度的變化十分敏感，對細胞尤其是原代細胞毒性較大，也不能采用RPMI培養(yǎng)基，因為其含有高濃度的磷酸鹽。

3、電穿孔轉染法

電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的小孔促使DNA分子進入胞內，這種方法就是電穿孔。

當遇到某些脂質體轉染效率很低或幾乎無法轉入時可以用電穿孔法轉染。

一般情況下，高電場強度會殺死50%-70% 的細胞。現在針對細胞死亡開發(fā)出了一種電轉保護劑，可以大大的降低細胞的死亡率，同時提高電穿孔轉染效率。

4、病毒感染

對于脂質體轉染與電穿孔轉染都無法成功轉染的細胞系可以采用病毒感染，腺病毒，腺相關病毒，逆轉錄病毒和慢病毒載體已廣用于哺乳動物細胞體內外的基因轉染，轉染效率比較高，適用于較難轉染的細胞。

但是插入的片段長度有一定限制，最重要的是技術難度比較高，在一般實驗室中很難普及，而且某些病毒起效時間比較慢，跟不上細胞這種快速繁殖的速度，如果只是做簡單細胞系的轉染性價比不高。

沒有一種方法適用于所有的細胞和實驗，理想的方法應根據細胞類型和實驗需要進行選擇，如果只是在細胞水平做，而且用的是簡單細胞系，那么脂質體轉染是綜合比較起來不錯的一個方法。

所以，我們主要來探討一下脂質體轉染：

進行實驗之前，請先規(guī)劃好你的實驗，一般細胞轉染需要24h-72h，所以要充分了解細胞生長速度，計算所需脂質體和DNA的儲備量，并確認有足夠的下列材料：Opti-MEM無血清培養(yǎng)基，Lipofectamine轉染試劑，以及DNA，這個一定要確認好，否則生氣都沒辦法怪別人。

做好以上準備后，具體的操作步驟如下：

1、細胞鋪板

(1)一般會選擇復蘇細胞傳代3-4次(匯合率達到90%之前對細胞進行傳代，不要長到100 %)，從解凍過程中恢復過來可以穩(wěn)定生長的細胞進行細胞轉染，傳代次數高(>30-40)時，細胞的生長速度和形態(tài)會改變。

(2)如果提總蛋白，一般選擇六孔板進行轉染，因為轉染的細胞提取蛋白的總量能達到200ug，一般夠做并且需要的DNA和Lipofectamine又相對比較少。

(3)傳代條件取決于所用的細胞系。對于快速生長的細胞，倍增時間為16小時(如HEK293)。對于生長緩慢的細胞，倍增時間為36小時(如原代細胞)。

(4)轉染當天，將細胞鋪板。如果在轉染前一 天或更早時間鋪板，轉染效率可能下降，如果是簡單細胞系的轉染，可以直接在前一 天晚上鋪板，第二天來轉染。轉染時，細胞密度會影響轉染效率，細胞密度保持在匯合率為70-90%(這個前提是轉染24h，如果轉染48h則需要匯合率為50-70%)，細胞的鋪板和轉染也可同時進行。

2、細胞轉染

吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。更換無血清培養(yǎng)基。準備轉染制備液，用滅菌后的EP管制備。

以六孔板為例，A液：用200μl Opti-MEM稀釋4μg質粒;B液:用200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加入至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。

加入轉染試劑到每個孔的培養(yǎng)基中，6h后，更換成**培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)到24-48小時(不同的質粒和脂質體**搭配比例不同，轉染前，應該摸一個**配比。質粒：脂質體=1：1，1：1.5，1：2，1：2.5，1：3，1：3.5的梯度比例來檢測**轉染比例，一般質粒有帶熒光，可以通過觀察每組熒光強弱來判斷轉染效率)。以下為不同規(guī)格的培養(yǎng)板需要加DNA和lipo2000的量。

轉染時，應使用優(yōu)質質粒：

1、通過測量OD 值來確定DNA純度和濃度，測得的OD值應介于1.7-1.9之間。脂質體轉染基于電荷吸引原理，如果DNA不純，如帶少量的鹽離子，蛋白，代謝物污染都會顯zhu影響轉染復合物的有效形成及轉染的進行。

2、含有內毒素的質粒對細胞有很大的毒性作用。

轉染時，小心輕柔的將lipo2000加到培養(yǎng)基中并輕輕混勻，避免粗暴用力吹打，會導致脂質體失效。

血清一度曾被認為會降低轉染效率，老一代的轉染方法往往要求轉染前后用PBS洗細胞然后在無血清培養(yǎng)基條件下轉染，但有些對此敏感的細胞會受到損傷，甚至死亡(比如貼壁較差的細胞，在PBS洗滌時很容易沖刷細胞)導致轉染效率極低。

不過轉染產品配方幾經革新后的當下，對于主流的轉染試劑來說，血清的存在已經不會影響轉染效率，甚至還有助于提高轉染效率，但是血清的存在會影響DNA-轉染復合物的形成，在DNA-轉染復合物形成時需用無血清培養(yǎng)基opti-MEM來稀釋DNA和轉染試劑，在轉染過程中是可以使用血清的。

轉染后6小時更換培養(yǎng)基，因為lipo2000具有一定毒性。

細胞培養(yǎng)過程中往往會添加抗生素來預防污染，但是抗生素可能對轉染造成困擾。比如青霉素和鏈霉素，青鏈霉素是我們常用來預防污染的抗生素，就會影響轉染，雖然這些抗生素一般情況下對于真核細胞無毒，但當轉染試劑增加了細胞的通透性時，就會使抗生素也進入細胞從而間接導致細胞死亡，造成轉染效率低。

目前轉染試劑有些已經可以全程都用有血清和抗生素的**培養(yǎng)基來操作，非常方便，省去了污染等麻煩。

3、觀察轉染的效果

在轉染后24小時，用熒光顯微鏡觀察實驗結果并記錄熒光蛋白表達情況，如下圖所示，說明轉染成功，且轉染效率還可以，如果不帶有熒光，可以用GFP來對照，可以放在一個單獨的孔中，或是與目標質粒共轉染，同時用Q-PCR和者WB來檢測。

轉染后發(fā)現轉染效率不高，可以通過兩種方法：

1、復轉染，即轉染后12-24小時再次進行轉染，前提是該細胞對脂質體的耐受性較好，轉染后細胞死亡數較少。

2、通過藥篩來殺死未轉入成功的細胞。前提是該質粒帶有抗生素抗性的基因。